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Products細胞破碎的方法
更新時間：2021-02-19 點擊次數(shù)：4108次
細胞破碎的方法
機械法
主要通過機械切力的作用使組織細胞破碎的方法，常用的器械有組織搗碎機、勻漿器、研缽和研磨、壓榨器等。
1. 組織搗碎機
將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至慢處，開動開關后，逐步加速至所需速度。一般用于動物組織、植物肉質(zhì)種子、柔嫩的葉芽等，轉(zhuǎn)速可高達10000rpm/M以上。由于旋轉(zhuǎn)刀片的機械切力很大,制備一些較大分子如核酸則很少使用。
2. 勻漿器
先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎。勻漿器的研缽磨球和玻璃管內(nèi)壁之間間隙保持在十分之幾毫米距離。制作勻漿器的材料，除玻璃外，還可以用硬質(zhì)塑料、不銹鋼、人造熒光樹脂等。此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。
存在的問題；較易造成堵塞的團狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性首以及有些亞細胞器，質(zhì)地堅硬，易損傷勻漿閥，也不適合用該法處理。
3. 研缽
多用于細菌或其他堅硬植物材料，研磨時常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨劑，以提高研磨效果。
4. 細菌磨
是一種改良了的研磨器，比研缽具有更大的研磨面積，而且低部有出口。操作時先把細菌和研磨粉調(diào)成糊狀，每次加入一小勺，研磨20-30秒即可將細菌細胞*磨碎。
物理法
主要通過各種物理因素使組織細胞破碎的方法。在生化制備中常用的方法有：
1. 反復凍溶法
原理：因突然冷凍，細胞內(nèi)冰晶的形成及 胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細胞。
方法：將待破碎的細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結(jié)構破碎。
特點：此法適用于組織細胞，多用于動物性材料，對微生物細胞作用較差。
2. 急熱驟冷法
將材料投入沸水中，維持85-90分鐘，至水浴中急速冷卻，此法可用于細菌及病毒材料。
3. 超聲波處理
用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，頻高于15～20KHz的超聲波在高強度聲能輸入下可以進行細胞破碎。其破碎機理：可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關。超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度及首種類型等因素有關。
特點：操作簡單，重復性較好，節(jié)省時間；多用于微生物和組織細胞的破碎。
存在問題：超聲波破碎在實驗室規(guī)模應用較普遍，處理少量樣品時操作簡便，液量損失少，但是超聲波產(chǎn)生的化學自由基團能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活。而且大容量裝置聲能傳遞，散熱均有困難，應采取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用?？栈饔檬羌毎茐牡闹苯釉颍瑫r會產(chǎn)生活性氧，所以要加一些巰基保護劑。
化學及生物化學法
1. 自溶法
在一定PH和適當?shù)臏囟认?，利用組織細胞內(nèi)自身的酶系統(tǒng)將。此過程需較長時間，常用少量防腐劑如甲苯、等防止細胞的污染。
2. 酶溶法
利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶、半纖維素酶、脂酶等，將細胞壁分解，使細胞內(nèi)含物釋放出來。有些細菌對溶菌酶不敏感，加入少量巰基試劑或8摩爾尿素處理后，使之轉(zhuǎn)為對溶菌酶敏感而溶解。
特點：
a） 此法適用多種微生物；
b） 具有作用條件溫和；
c） 內(nèi)含物成分不易受到破壞；
d） 細胞壁損壞的程度可以控制。
存在的問題：易造成產(chǎn)物抑制作用，這可能是導致胞內(nèi)物質(zhì)釋放率低的一個重要因素。而且溶酶價格高，限制了大規(guī)模利用。若回收溶酶，則又增加百分離純化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差，不同菌種需選擇不同的酶。有一定局限性，不適宜大量的蛋白質(zhì)提取，給進一步純化帶來困難。
3. 化學滲透法
某些有機溶劑（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性劑、金屬螯合劑、變性劑等化學藥品都可以改變細胞壁或膜的通透性從而使內(nèi)合物有選擇地滲透出來。其作用機理；化學滲透取決于化學試劑的類型以及細胞壁和膜的結(jié)構與組成。
特點：多用于破碎細菌，且作用比較溫和；提取核酸時，常用此法破碎細胞。
存在的問題：時間長，效率低；化學試劑毒性較強，同時對產(chǎn)物也有毒害作用，進一步分離時需要用透析等方法除去這些試劑；通用性差：某種試劑只能作用于某些特定類型的微生物細胞。
小結(jié)
無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。
介紹的幾種，可謂各有千秋，在實際應用中，應盡量考慮全面，選擇科學、有效的方法。|||順便提個問題：
關于反復凍融有很多資料，但是都不夠詳細，想請教做過這方面的酷友們：
1、重懸緩沖液（裂解液？，PBS？）
2、凍溶溫度（液氮？，-20？，-80？）
3、解凍溫度（37？，40？）
4、反復次數(shù)（3 次以上？）反復凍融實際上與超聲波破碎或酶解一起使用，否則凍融后黏度很大，蛋白質(zhì)容易聚集，通常都是反復凍融后超聲波處理，這樣效果比較好<br />
你問的幾個問題其實都沒有具體答案，緩沖液，溫度等都與具體蛋白質(zhì)，具體實驗要求有關，次數(shù)是基本達到你的要求即可
主要通過機械切力的作用使組織細胞破碎的方法，常用的器械有組織搗碎機、勻漿器、研缽和研磨、壓榨器等。
1. 組織搗碎機
將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至慢處，開動開關后，逐步加速至所需速度。一般用于動物組織、植物肉質(zhì)種子、柔嫩的葉芽等，轉(zhuǎn)速可高達10000rpm/M以上。由于旋轉(zhuǎn)刀片的機械切力很大,制備一些較大分子如核酸則很少使用。
2. 勻漿器
先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎。勻漿器的研缽磨球和玻璃管內(nèi)壁之間間隙保持在十分之幾毫米距離。制作勻漿器的材料，除玻璃外，還可以用硬質(zhì)塑料、不銹鋼、人造熒光樹脂等。此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。
存在的問題；較易造成堵塞的團狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性首以及有些亞細胞器，質(zhì)地堅硬，易損傷勻漿閥，也不適合用該法處理。
3. 研缽
多用于細菌或其他堅硬植物材料，研磨時常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨劑，以提高研磨效果。
4. 細菌磨
是一種改良了的研磨器，比研缽具有更大的研磨面積，而且低部有出口。操作時先把細菌和研磨粉調(diào)成糊狀，每次加入一小勺，研磨20-30秒即可將細菌細胞*磨碎。
物理法
主要通過各種物理因素使組織細胞破碎的方法。在生化制備中常用的方法有：
1. 反復凍溶法
原理：因突然冷凍，細胞內(nèi)冰晶的形成及 胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細胞。
方法：將待破碎的細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結(jié)構破碎。
特點：此法適用于組織細胞，多用于動物性材料，對微生物細胞作用較差。
2. 急熱驟冷法
將材料投入沸水中，維持85-90分鐘，至水浴中急速冷卻，此法可用于細菌及病毒材料。
3. 超聲波處理
用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，頻高于15～20KHz的超聲波在高強度聲能輸入下可以進行細胞破碎。其破碎機理：可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關。超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度及首種類型等因素有關。
特點：操作簡單，重復性較好，節(jié)省時間；多用于微生物和組織細胞的破碎。
存在問題：超聲波破碎在實驗室規(guī)模應用較普遍，處理少量樣品時操作簡便，液量損失少，但是超聲波產(chǎn)生的化學自由基團能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活。而且大容量裝置聲能傳遞，散熱均有困難，應采取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用?？栈饔檬羌毎茐牡闹苯釉颍瑫r會產(chǎn)生活性氧，所以要加一些巰基保護劑。
化學及生物化學法
1. 自溶法
在一定PH和適當?shù)臏囟认?，利用組織細胞內(nèi)自身的酶系統(tǒng)將。此過程需較長時間，常用少量防腐劑如甲苯、等防止細胞的污染。
2. 酶溶法
利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶、半纖維素酶、脂酶等，將細胞壁分解，使細胞內(nèi)含物釋放出來。有些細菌對溶菌酶不敏感，加入少量巰基試劑或8摩爾尿素處理后，使之轉(zhuǎn)為對溶菌酶敏感而溶解。
特點：
a） 此法適用多種微生物；
b） 具有作用條件溫和；
c） 內(nèi)含物成分不易受到破壞；
d） 細胞壁損壞的程度可以控制。
存在的問題：易造成產(chǎn)物抑制作用，這可能是導致胞內(nèi)物質(zhì)釋放率低的一個重要因素。而且溶酶價格高，限制了大規(guī)模利用。若回收溶酶，則又增加百分離純化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差，不同菌種需選擇不同的酶。有一定局限性，不適宜大量的蛋白質(zhì)提取，給進一步純化帶來困難。
3. 化學滲透法
某些有機溶劑（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性劑、金屬螯合劑、變性劑等化學藥品都可以改變細胞壁或膜的通透性從而使內(nèi)合物有選擇地滲透出來。其作用機理；化學滲透取決于化學試劑的類型以及細胞壁和膜的結(jié)構與組成。
特點：多用于破碎細菌，且作用比較溫和；提取核酸時，常用此法破碎細胞。
存在的問題：時間長，效率低；化學試劑毒性較強，同時對產(chǎn)物也有毒害作用，進一步分離時需要用透析等方法除去這些試劑；通用性差：某種試劑只能作用于某些特定類型的微生物細胞。
小結(jié)
無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。
介紹的幾種，可謂各有千秋，在實際應用中，應盡量考慮全面，選擇科學、有效的方法。|||順便提個問題：
關于反復凍融有很多資料，但是都不夠詳細，想請教做過這方面的酷友們：
1、重懸緩沖液（裂解液？，PBS？）
2、凍溶溫度（液氮？，-20？，-80？）
3、解凍溫度（37？，40？）
4、反復次數(shù)（3 次以上？）反復凍融實際上與超聲波破碎或酶解一起使用，否則凍融后黏度很大，蛋白質(zhì)容易聚集，通常都是反復凍融后超聲波處理，這樣效果比較好<br />
你問的幾個問題其實都沒有具體答案，緩沖液，溫度等都與具體蛋白質(zhì)，具體實驗要求有關，次數(shù)是基本達到你的要求即可
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